Một diễn viên nổi tiếng, John Wilkes Booth, là gián điệp của Liên minh đến từ Maryland; dù chưa bao giờ gia nhập quân đội Liên minh, Booth có mối quan hệ với mật vụ Liên minh.[178] Năm 1864, Booth lên kế hoạch bắt cóc Lincoln để đòi thả tù binh Liên minh. Nhưng sau khi dự buổi diễn thuyết của Lincoln vào ngày 11 tháng 4 năm 1865, Booth giận dữ thay đổi kế hoạch và quyết định ám sát tổng thống.[179] Dò biết Tổng thống, Đệ Nhất Phu nhân, và Tướng Ulysses S. Grant, nhân vì ăn mừng việc chấm dứt chiến tranh, sẽ đến Nhà hát Ford, Booth cùng đồng bọn lập kế hoạch ám sát Phó Tổng thống Andrew Johnson, Bộ trưởng Ngoại giao William H. Seward, và Tướng Grant. Ngày 14 tháng 4, Lincoln đến xem vở kịch "Our American Cousin" mà không có cận vệ chính Ward Hill Lamon đi cùng. Đến phút chót, thay vì đi xem kịch, Grant cùng vợ đến Philadelphia.[180]

Trong lúc nghỉ giải lao, John Parker, cận vệ của Lincoln, rời nhà hát cùng người đánh xe đến quán rượu Star kế cận. Lợi dụng cơ hội Tổng thống ngồi trong lô danh dự mà không có cận vệ bên cạnh, khoảng 10 giờ tối, Booth lẻn vào và bắn vào sau đầu của Tổng thống từ cự ly gần. Thiếu tá Henry Rathbone chụp bắt Booth nhưng hung thủ đâm trúng Rathbone và trốn thoát.[181][182]

Sau mười ngày đào tẩu, người ta tìm thấy Booth tại một nông trang ở Virginia, khoảng 30 dặm (48 km) phía nam Washington D. C. Ngày 26 tháng 4, sau một cuộc đụng độ ngắn, Booth bị binh sĩ Liên bang giết chết.[183]

Sau cơn hôn mê kéo dài chín giờ, Lincoln từ trần lúc 7g 22 sáng ngày 15 tháng 4. Mục sư Phineas Densmore Gurley thuộc Giáo hội Trưởng Lão được mời cầu nguyện sau khi Bộ trưởng Chiến tranh Stanton chào tiễn biệt và nói, "Nay ông thuộc về lịch sử."[184]

Thi thể của Lincoln được phủ quốc kỳ và được các sĩ quan Liên bang hộ tống dưới cơn mưa về Tòa Bạch Ốc trong tiếng chuông nhà thờ của thành phố. Phó Tổng thống Johnson tuyên thệ nhậm chức lúc 10:00 sáng ngay trong ngày Tổng thống bị ám sát. Suốt ba tuần lễ, đoàn tàu hỏa dành cho tang lễ Tổng thống mang thi thể ông đến các thành phố trên khắp miền Bắc đến các lễ tưởng niệm có hàng trăm ngàn người tham dự, trong khi nhiều người khác tụ tập dọc theo lộ trình giăng biểu ngữ, đốt lửa, và hát thánh ca.[185][186]